Везикулярный транспорт

Пути транспорта белков в клетке

Пути транспорта в клетке

Синтез белка всегда начинается в цитоплазме. Окончание синтеза происходит в цитоплазме либо на шероховатом эндоплазматическом ретикулуме (ШЭР).
Можно условно выделить два пути транспорта белка в клетке:
1. Из цитоплазмы в некоторые органеллы (ядро, пластиды, митохондрии)
2. Большой путь везикулярного транспорта из ШЭР через аппарат Гольджи (АГ) к другим органеллам (лизосомы, пероксисомы) и через секреторные везикулы во внеклеточную среду. Поскольку синтез всех белков начинается в цитоплазме, а конечная локализация каждого белка может быть различна внутри полипептида имеется система сигналов определяющая его транспортный путь. Первичный сигнал определяет путь из цитоплазмы (в ШЭР, в ядро, в митохондрию или в пластиду), вторичный сигнал определяет дальнейшее направление, например, внешняя или внутренняя мембрана митохондрии или матрикс; лизосома, пероксисома или секреторная гранула.

Сигнальные последовательности белков

Сигнальные последовательности имеют длину 3-80 аминокислот узнаются специфическими рецепторами на мембранах различных компартментов клетки.
Сигнальная последовательность ЭР - гидрофобный участок 5-15 аминокислот на N-конце полипептида.
Сигнал митохондриальных белков 20-80 аминокислот состоящий из спирали и торчащих концов - (+)-заряженного и гидрофобного. 5 (+)-заряженных аминокислот для транспортировки в ядро. Пероксисомные белки имеют последовательность на С-конце Ser-Lys-Leu-COOH.
Имеется класс сигнальных последовательностей которые не позволяют белку достигшему определенной локализации транспортироваться дальше. Например, мотив Lys-Asp-Glu-Leu-COOH (KDEL) не позволяет белкам покидать эндоплазматический ретикулум.

Одна из функций гладкого ЭР - удержание кальция готового для выпуска в цитозоль при стимуляции клетки. Кальретикулин - белок удерживающий ионы кальция. Первые 17 аминокислот включают 14 гидрофобных (синие) - сигнальная последовательность для проникновения в ЭР из цитозоля. Последние четыре аминокислоты KDEL удерживают белок в ЭР.
(NH2)MLLSVPLLLGLLGLAVAEPAVYFKEQFLDGDGWTSRWIESKHKSDFGKFVLSSGKF
YGDEEKDKGLQTSQDARFYALSASFEPFSNKGQTLVVQFTVKHEQNIDCGGGYVKLFP
NSLDQTDMHGDSEYNIMFGPDICGPGTKKVHVIFNYKGKNVLINKDIRCKDDEFTHLYTLIVRP
DNTYEVKIDNSQVESGSLEDDWDFLPPKKIKDPDASKPEDWDERAKIDDPTDSKP
EDWDKPEHIPDPDAKKPEDWDEEMDGEWEPPVIQNPEYKGEWKPRQI
DNPDYKGTWIHPEIDNPEYSPDPSIYAYDNF
GVLGLDLWQVKSGTIFDNFLITNDEAYAEEFGNETWGVTKAAEKQMKDKQDEEQRL
KEEEEDKKRKEEEEAEDKEDDEDKDEDEEDEEDKEEDEEEDVPGQAKDEL(COOH)

]]>сервер для предсказания сигнальных последовательностей белков]]>
Некоторые белки имеют различные локализации в клетки. Существует несколько путей транспортировки идентичных полипептидов в различные компартменты клетки [Karniely, 2005]:
1. Несколько сигнальных последовательностей в одном полипептиде преднозначенные для разных компартментов. Каталаза А дрожжей имеет две сигнальные последовательности - для митохондрий и пероксисом, причем количество фермента в этих органеллах зависит от состава среды. Некоторые цитохромы имеют два сигнала - митохондриальный и ЭР. Митохондриальный сигнал запускается после посттрансляционного фосфорилирования белка. Известно, что белок-предшественник амилоида болезни Альцгеймера также имеет два сигнала локализации - ЭР и митохондрий.
2. Одна сигнальная последовательность узнается различными рецепторами на поверхности компартментов. Например, некоторые белки митохондрий и хлоропластов имеют общую сигнальную последовательность, которая более гидрофобна чем специфические сигналы.
3. Сигнал может быть блокирован другим белком. Апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза 1 (Apn1) - основной фермент эксцизионной репарации репарации ДНК в ядре и митохондриях. С-конец имеет сигнал ядерной локализации (NLS), за которым идет сигнал митохондриальной локализации. белок Pir1 взаимодействует с С-концом Apn1 блокируя NLS.
4. Сигнал может быть блокирован специфическим сворачиванием белка. Аденилат-киназа дрожжей Aky2 локализуется в цитоплазме и в небольшом количестве в межмембранном пространстве митохондрий, имеет две сигнальные последовательности, активность которых зависит от конформации белка.
5. Сигнал может быть блокирован после модификации полипептида. Фосфорилированный цитохром CYP2B1, взаимодействует с цитозольным шапероном Hsp70, что приводит к конформационным изменениям и переключает одну сигнальную последовательность на другую.
6. Одна РНК может иметь два сайта инициации трансляции при этом образуются два белка - один с сигнальной последовательностью, другой без нее, что определит различную локализацию белков в клетке. В другом случае может образовываться две различные РНК кодирующие два идентичных белка, но у одного будет сигнальная последовательность, а у другого нет.

Транспорт в ядро

Транспорт в митохондрии и пластиды

Митохондрии и пластиды имеют собственную ДНК и самостоятельно синтезируют некоторые белки. Однако многие из основных белков митохондрий и пластид синтезируются в цитозоле.
Белки проникающие в митохондрии должны нести сигнал, определяющий локализацию - внутрення или наружная мембрана, или матрикс.
Белки преднозначенные для матрикса несут сигнал на N-конце, который узнается рецепторами на внешней мембране. Рецептор связан с комплексом переноса белка, который разворачивает белок и переносит его через мембрану. После переноса белка сигнальная последовательность отрезается и белок снова сворачивается.
Белки шапероны связываются с вновь синтезированным белком предотвращая его сворачивание.
Шаперонины связываются с белком после его транспортировки к месту доставки и способствуют правильному сворачиванию.
В ответ на различные стрессовые воздействия (например повышение температуры) в клетке синтезируются шапероны называемые белками теплового шока - hsp (heat-shock proteins), которые стабилизируют клеточные белки. Hsp обнаружены во всех клеточных компартментах эукариот и у бактерий.

Везукулярный транспорт

Из одной органеллы в другую перемещение происходит в везикуле или на ее поверхности в виде интегральных белков.
Донорый компартмент – органелла от которой отрывается мембрана в составе везикулы, акцепторный компартмент – принимает везикулу.
конститутивная секреция – происходит постоянно и не зависит от внешних сигналов.
регулируемая секреция – под ПМ происходит накопление пузырьков, которые сливаются с ПМ при наличии внешних сигналов – гормоны, нервы – и повышении конц. Ca2+ до 1мкм
ретроградный транспорт – возвращение рецепторных белков и липидов из АГ в Эр - восполнение мембраны ЭР.
антероградный транспорт – растворимые грузовые белки двигаются по секреторному пути ЭР→ пузырек?цис-Гольджи?пузырек?транс-Гольджи?пузырек?органелла или секреция
Окаймленные везикулы - покрыты белками, кот узнают и концентрируют специфич. м-ные белки и отделяют м-ну пузырька, формируют решетку и придают форму везикуле: клатриновые, COPI, COPII:
Клатриновые везикулы – ~0,1мкм, транспорт из АГ и ПМ,клатрин - 3типа, 3 большие и 3 малые субъединицы формирующие трискелетон – собирающиеся на поверхности м-ны со стороны цитоплазмы в пента- и гексагоны, кот спонтанно формируют сферу. Адаптин – связывает клатрин с м-ной и ловит различные трансм-ные белки в том числе грузовые рецепторы, кот. захватывают р-римые грузовые белки, кот попадают внутрь везикулы. Имеетя по крайней мере 4 типа адаптинов
динамин - GTP-аза, р-римый цитоплазматический белок, образует кольцо на отделяющейся клатриновой везикуле – регулирует кол-во клатрина отщепляющееся вместе с м-ной в составе везикулы, ассоциирует другие белки помогающие выпучить м-ну и белки модификаторы липидов, изменяющие локально липидный состав м-ны для выпучивания
После отделения везикулы от м-ны клатрин и адипин отделяют шапероны - ATP-азы hsp70 семейства. Ауксилин – прикрепляется к везикуле и активирует АТФ-азу. Т.к кайма формирующейся везикулы сущ. дольше чем кайма отделенной – имеется стабилизирующий механизм. Клатриновая оболочка обеспечивает значительную силу для изгибания м-ны, т.к. везикулы из внутриклеточных компартментов образуются на уже выпученной м-не
COP-I – транспорт от АГ и ЭР, 8субъединиц, GTP-белок – фактор рибозилирования АДФ –ARF – транспорт
COP-II – транспорт из АГ и ЭР, 5 субъединиц
Везикулы мб не только сферические, часто образуются трубчатые везикулы в которых высокое соотношение S/V
Образование клатриновых и COP везикул регулируется GTP-связывающими белками, которые могут находится в активном GTP- и неактивном GDP-состоянии
Два класса белков обменивают GDP-GTP: GEF-гуанин-нуклеотид-фактор обмена активирует белки заменяя GDF?GTF, GAP- белок активирующий GTP-азы – инактивирует GTP-связывающие белки меняя GTP?GDP.
GTP-азы необходимые для сборки окаймленных везикул перед сборкой пузырьков: мономерные GTP-связывающие белки (GTP-азы):
ARF-белки – необх для клатриновой и COP сборки на пов-ти м-ны АГ. Sar1 белок, необходим для COPII сборки на на ЭР м-не
тримерные (G белки).
GTP-азы находятся в цитозоле в неактивном состоянии, перед сборкой GEF встраивается в м-ну ЭР и связывает цитозольный SarI, кот обменивает GDF?GTP. В GTP состоянии SarI встраивается остатком жирной к-ты в м-ну ЭР. Ассоциирует белки об-ки и инициирует отпочковывание везикулы. GTP-азы попавшие в м-ну активируют фосфолипазу D, кот преобразует фосфолипиды в фосфотидную к-ту, что усиливает связывание оболочных белков. Вместе белок-белковые и белок-липидные взаимодействия изгибают м-ну
SNARE – белки – отвечают за слияние донорной и акцепторной м-н, более 20, каждая на специфич пов-ти м-ны, трансмембранные белки на пов-ти везикулы - v-SNAR, на пов-ти донора – t-SNAR. Взаимодействуя v- и t-SNAR обвиваются др на друга в транс-SNAR-комплекс, обеспечивающий слияние м-н. SNF-белок разрушает транс-SNAR-комплексы – цитозольный шаперон ATP-аза, использует адаптирующие белки для связывания с комплексом-SNAR
Rab-белки – мономерные GTP-азы, более 30, каждая органелла имеет хотя бы один Rab на м-не со стороны цитоплазмы, регулируют стыковку везикул и связывание v-SNAR-ов и t-SNAR-ов необходимых для слияния м-н. В состоянии GDP-не активны, нах в цитозоле, в состоянии GTP-активны и переходят на пов-ть м-ны органеллы или везикулы. В активном состоянии Rap связываются с м-ной липидным якорем и собирают другие белки участвующие в слиянии м-н
неактивный Rab-GDP связан с GDI – GDP-диссоциирующий ингибитор. Rab-GDP связывается с GEF-гуанин нуклеотид меняющий фактор, связанный с м-ной донорного компартмента – меняет GDP на GTP. Rab-GTP связывается с м-ной формирующейся везикулы и ассоциирует v-SNARE, которые в составе везикулы транспортируются к органелле и связываются с Rab-эффекторами и t-SNARE, связанными с м-ной акцепторного компартмента и обеспечивают слияние м-н
белок органелла
Rab1 ЭР и АГ
Rab2 цис-АГ
Rab3A синаптич везикулы, секрет гранулы
Rab4 ранние эндосомы
Rab5A ПМ, клатриновые везикулы
Rab5C ранние эндосомы
Rab6 промежуточный- и транс-АГ
Rab7 поздние эндосомы
Rab8 секреторные везикулы (базолатеральные)
Rab9 поздние эндосомы, trans-АГ
Слияние м-н происходит не только при везикулярном транспорте: слияние спермия с яйцом, слияние миобластов во время развития мышечной клетки.

Образование клатринового пузырька. Диаметр клатринового пузырька ~0,3 мкм

клатриновая везикула

Транспорт малых молекул

Контроль клеточного цикла

Участники контроля клеточного цикла

Контрольные точки клеточного цикла

Контроль различных этапов клеточного цикла

Циклин-зависимые киназы

Циклины

Субстраты циклинов

APC комплекс

Ингибиторы комплексов Cdk-циклин

Участники контроля клеточного цикла

Клеточный цикл контролируется путем взаимодействия трех типов
белков: циклинзависимые киназы (Cdk), циклины
- белки, взаимодействующие с Cdk c образованием комплексов
и ингибиторы комплексов Cdk-циклин.

Циклинзависимые киназы (Cdk) - ферменты фосфорилирующие другие
белки, изменяют их функцию. Клеточный цикл контролируется изменением
активности Cdk, которая регулируется периодическим образованием
и распадом их регуляторных субъединиц - циклинов. Смена синтезов
и разрушений различных циклинов обеспечивает переходы и протекания
различных фаз клеточного цикла. При этом концентрация Cdk
постоянна в течении всего клеточного цикла. В разные фазы
клеточного цикла образуются разные циклины, которые связываясь
с Cdk образуют различные Cdk-циклиновые комплексы. Эти комплексы
регулируют разные фазы клеточного цикла и поэтому называются
G₁-, G₁/S- , S- и М-Cdk (рис.1).

рис.1 Концентрации различных комплексов Cdk-циклин
в клеточном цикле.

Контрольные точки клеточного цикла

1. Точка выхода из G₁-фазы, называемая
Старт - у млекопитающих и точкой рестрикции
у дрожжей. После перехода через точку рестрикции R в конце
G₁ наступление S становится необратимым, т.е. запускаются
процессы ведущие к следующему делению клетки.
2.
Точка S – проверка точности репликации.
3.
Точка G₂/M-перехода – проверка завершения репликации.

4. Переход от метафазы к анафазе митоза.

Контроль различных этапов клеточного
цикла

ARC подавляет S- и M-циклины и не подавляет G₁/S-циклины.

В G₁-фазе работают различные ингибиторы Cdk.

Внутренние и внешнии сигналы приводят к образованию G₁/S-
и S-циклинов и активации G₁/S–Cdks.

Активность G1/S–Cdk увеличивается потому что G1/S циклины
не атакуются APC и потому что G₁

Cdk ингибиторы так же не действуют на G₁/S–Cdks
(у мух и дрожжей) или удаляются от G₁/S–Cdks другими
механизмами (у млекопитающих).

S-Cdk инактивирует ингибиторы Cdk и подавляет ARC, которые
в G₁-фазе подавляли S-Cdk. S-Cdk фосфорилируют
различные белки, что ведет к началу дупликации ДНК и S-фазы.
После начала S-фазы S/G₁-Cdk обеспечивают собственную
инактивацию.

В конце S-фазы, в G₂-фазе начинают накапливаться
М-Cdk, приводящая к вступлению клетки в митоз. М-Cdk активирует
ARC-комплекс, управляющий метафазно-анафазным переходом. Основная
функция ARC-комплекса состоит в разрушении когезинов, приводящее
к началу расхождения хромосом

Циклин зависимые киназы Cdk1-5 в клетках млекопитающих

Cdks активируется при связывании с циклинами (так же как фосфориляция
и дефосфориляция киназ). Cdks-фосфорилируют белки участвующие
в кл цикле

M-phase Cdk (M-Cdk) запускают каскад белковых фосфориляций,
запускающих М-фазу к.ц. (конденсация хромосом, разрушение
ядра, перестройка АГ иЭР, потеря адгезии с большинством других
клеток и внеклеточному матриксу, реорганизация цитоскелета)

anaphase-promoting complex (APC) регулятор митоза – инициация
разделения и расхождения хромосом и инактивация М-Cdk в конце
митоза

При выходе из G₀ под действием факторов роста начинает
синтезироваться Cdk2-циклинD: распознает в-ва, регулирующие
ферменты синтеза белков, необходимых для репликации ДНК. В
это же время выявляются Cdk4-циклинD, и Cdk5циклинD

циклин-cdks
запускает М-стадию кц, деградация циклина снижает активность
cdks

Cdk2-циклинE появляется в G₁ и достигает max
на границе G₁-S, после чего его концентрация
резко снижается

Cdk2-циклинА появляется в промежутке G₁-S и присутствует
в высокой концентрации на протяжении S

Сdk2-циклинB в конце G₂ до М – резко разрушается

в каждой стадии синтезируются свои циклины M-циклины запускают
события митоза, G₁/S-циклины – связывают цзк
в конце G₁ подготавливает кл к S-фазе, S-циклины
– связывают цзк, запуская репликацию, G₁-циклины
обеспечивают прохождение через точку рестрикции.

Регуляция репликации

Перед началом репликации Sc ORC-комплекс (origin recognition
complex) садится на ori - точку начала репликации. Cdc6 представлен
во всем клеточном цикле, но его концентрация возрастает вначале
G1, где он связывается c ОRC комплексом, к которому затем
присоединяются Mcm белки с образованием pre-replicative complex
(pre-RC). После сборки pre-RC клетка готова к репликации.

Для инициации репликации S-Cdk соединяется с протеинкиназой
(?), которая фосфорилирует pre-RC. При этом Cdc6 диссоциирует
от ОRC после начала репликации и фосфорилируется, после чего
убиквитинируется SCF и деградирует. Изменения в pre-RC препятствуют
повторному запуску репликации. S-Cdk так же фосфорилирует
некоторые Mcm белковые комплексы, что запускает их экспорт
из ядра. Последующая дефосфориляция белков вновь запустит
процесс образования pre-RC.

Регуляция митоза

В эмбриональных клетках синтез М-циклина постоянен во всем
клеточном цикле и накопление его происходит из-за уменьшения
деградации. У большинства клеток М-циклин синтезируется во
время G2 и М-фаз. Накопление циклина ведет к накоплению M-Cdk.
Cdk ингибируется, фосфорилируясь протеинкиназой Wee1. Активация
Cdc25 в поздней G2 дефосфорилирует M-Cdk, так же происходит
репрессия Wee1. Две протеинкиназы фосфорилируют Cdc25 – Polo
kinase и M-Cdk. M-Cdk так же фосфорилирует и ингибирует Wee1.
Способность M-Cdk активировать свой собственный активатор
(Cdc25) и ингибировать свой собственный ингибитор (Wee1) предполагает,
что активация M-Cdk в митозе резко усиливается при наличии
такой позитивной обратной связи. Малое количество активированных
Cdc25 активируют M-Cdk, которые активирует еще больше Cdc25
и супрессируют Wee1. Это приводит к большей дефосфориляции
M-Cdk и активации и тд. Такой механизм обеспечивает полную
активацию всех M-Cdk

Фосфорилирование ламинов M-Cdk приводит к их деградации. М-Cdk
фосфорилирует несколько субъединиц конденсинов, запуская конденсацию
хромосом.

M-Cdk фосфорилирует различные белки, запуская реорганизацию
микротрубочек и другие события ведущие к организации веретена
деления.

Циклин-зависимые
киназы

В животных клетках имеются, по крайней мере, 7 различных
Cdk. Cdk1,2,4,6 напрямую участвуют в регуляции клеточного
цикла, тогда как остальные фосфорилируют другие Cdk и называются
Cdk-активирующие киназы (CAK).

Cdk7,8,9 являются регуляторами РНК полимеразы II. Cdk5 участвует
в дифференцировке нервных клеток.

У дрожжей Sc и Sp все события клеточного цикла контролируются
одной Cdk1. У многоклеточных организмов события контролируются
Cdk1 и Cdk2. Также у высших эукариот имеются Cdk4 и Cdk6
которые регулируют клеточный цикл в ответ на внеклеточные
сигналы.

Cdk фосфорилируют сотни различных белков по сериновым (S)
или треониновым (T) аминокислотным остаткам. Cdk узнает
мотиф другого белка по которому необходимо фосфорилировать:
[S/T*]PX[K/R], где S/T*- место фосфорилирования, X – любая
аминокислота, K/R-основные аминокислоты лизин (K) или аргинин
(R).

В отсутствии циклина активный центр Cdk заблокирован.

Cdk состоит из нескольких доменов: Т-петля (инактивирующая
петля) – закрывает активный центр в отсутствии циклина.
L12 helix, PSTAIRE helix.

Циклины

Циклины - цитоплазматические белки. Разрушение циклинов
происходит в протеосомах (см. обзор Протеасомы). Циклин
B – белок киназный домен, регуляторная субъединица. Начинает
синтезироваться в G1, достигает max в S и ранней профазе
и быстро разрушается в начале анафазы М. Когда концентрация
регуляторной субъединицы возрастает – активируется киназный
домен. Фосфорилирование специфических белков приводит к
компактизации х-м, разрушению ядерной об-ки и сборке веретена.

Циклин разрушается в протеасомах. Сигнальная послед-ть из
8-10 а-кт –блок разрушения - узнается распознающим белком,
убиквитинлигаза присоединиет убиквитин (76а-кт) к остаткам
лизина, который полиUb и узнается РНК-белковым комплексом
протеасомой. Фосфатаза переводит распознающий белок в неактивное
состояние, а циклин фосфорилирует переводя в активное ?чем
больше циклина, тем быстрее он разрушается.

Циклин фосфорилирует сериновые и треониновые остатки ламинов
вызывая их деполимеризацию, фосфорилирует гистон H1, участвует
в фосфорилировании блокирующим везикулярный транспорт –
разрушение ЭПР и АГ, фосфорилирует участок легкой цепи миозина,
ингибируя АТФ-азную активность и связывание с F-актином
– блокировка цитокинеза в раннем митозе. После разрушения
циклина белки дефосфорилируются.

Циклины – активаторы Cdk. Циклины, так же как и Cdk вовлечены
в различные, помимо контроля клеточного цикла, процессы.
Циклины разделяются на 4 класса в зависимости от времени
действия в клеточном цикле: G1/S, S, M и G1 циклины.

G1/S циклины (Cln1 и Cln2 у S. cerevisiae, циклин E у позвоночных)
достигает максимальной концентрации в поздней G1-фазе и
падает в S-фазе.

G1/S cyclin–Cdk комплекс запускает начало репликации ДНК
выключая различные системы подавляющие S-phase Cdk в G1-фазе

G1/S циклины также инициируют дупликацию центросом у позвоночных,
образование веретенного тела у дрожжей. Падение уровня G1/S
сопровождается увеличением концентрации S циклинов (Clb5,
Clb6 у Sc и циклин A у позвоночных), который образует S
циклин-Cdk комплекс который напрямую стимулирует ДНК репликацию.
Уровень S циклина остается высоким в течении всей S, G2-фаз
и начала митоза, где помогает началу митозу в некоторых
клетках.

М-циклины (Clb1,2,3 и 4 у Sc, циклин B у позвоночных) появляется
последним. Его концентрация увеличивается, когда клетка
переходит к митозу и достигает максимума в метафазе. М-циклин-Cdk-комплекс
включает сборку веретена деления и выравнивание сестринских
хроматид. Его разрушение в анафазе приводит к выходу из
митоза и цитокиезу.

G1 циклины (Cln3 у Sc и циклин D у позвоночных) помогает
координировать клеточный рост с входом в новый клеточный
цикл. Они необычны, так как их концентрация не меняется
от фазы клеточного цикла, а меняется в ответ на внешние
регуляторные сигналы роста.

APC комплекс (Anaphase-Promoting Complex)

Убиквитин лигаза митоза - APC состоит из 12 субъединиц и регулирует
различные процессы митоза, такие как разделение сестринских
хроматид (запускает разрушение когезинов), переход к анафазе,
анафазное расхождение хромосом, выход из митоза, разрешение
S-фазы. ARC разрушает митотический циклин B.

Имеются различные белки регулирующие активность ARC комплекса,
такие как Mps1, Bub1, Bub3, BubR1, Mad1 и Mad2. Они ингибируют
ARC комплекс, что ведет к остановке клеточного цикла в метафазе
митоза.

Ингибиторы комплексов циклин-Cdk

Помимо циклинов имеются и другие регуляторы, такие как
p27, p53, анафазный ингибитор, Cdc20, polo-like киназа,
aurora киназа, Nek2 киназа и кинезинзависимые моторные белки.

p53 (опухолевый супрессор) - нестабильный
белок, узнает поврежденную ДНК, стабилизируется, накапливается
и стимулирует синтез ингибитора Cdk2. Нарушения в работе
p53 приводят к развитию раковых заболеваний.

p21 семейство - белки содержащие гомологичные
N-концевые участки, взаимодействующие с Cdk-циклинами. Активируются
в стареющих клетках. Образование индуцируется опухолевым
супрессором p53. Может блокировать субъединицы ДНК-полимеразы

p27 - межклеточные контакты стимулируют
его синтез - контактное подавление клеточного роста – задержка
в G₀. Когда фибробласты помещаются в чашку они
начинают делиться пока монослой не покроет чашку – контактное
торможение. В опытах показано что существенную роль играют
не контакты, а степень распластывания – чем меньше распластана
клетка, тем больше времени занимает клеточный цикл. Округление
клеток сопровождается снижением общей интенсивности белкового
синтеза.

p57

p15, p16 семейство: взаимодействуют
с Cdk4 и Cdk6. Нарушают связь с циклинами D. Вероятно, задерживают
рост клеток.

Сокращения:

cdc-гены (cell-division-cycle genes) - гены клеточного цикла.

Мейоз

Основные события мейоза
Продолжительность мейоза
Премейотическая интерфаза
Профаза I
Лептотена
Зиготена
Пахитена
Диплотена
Диакинез
Метафаза I
Анафаза
Телофаза
Интеркинез
Второе деление мейоза
Гаметогенез

Основные события мейоза
Мейоз – тип митоза, или редукционное деление, при котором из одной клетки образуется четыре, каждая из которых имеет вдвое меньше хромосом чем исходная; т.е. число хромосом уменьшается с диплоидного (2n) до гаплоидного (n). Мейоз происходит при образовании гамет - гаметный, при образовании спор - споровый и мейоз может быть зиготным. Смысл гаметного мейоза сводится к образованию половых клеток, при слиянии которых, восстанавливается число хромосом (до диплоидного) характерное для соматических клеток данного вида. Споровый тип мейоза происходит у растений для которых характерно чередование поколений - гаплоидного, размножающегося бесполым путем и диплоидного, размножающегося половым путем (см. обзор Размножение).

рис.1 Принципиальная схема мейоза. В соматических диплоидных клетках содержат две гомологичные хромосомы, одна отцовская и одна материнская. Они удваиваются в S-фазе клеточного цикла, образуя две пары сестринских хроматид. Хромосомы сближаются и между ними происходит кроссинговер - обмен участками между материнской и отцовской парами хроматид с образованием хроматид содержащих отцовские и материнские гены. Хромосомы конденсируются, выстраиваются и расходятся. Затем происходит второе деление мейоза.Стадии мейоза 2n-->S-->4n-->2x2n-->4x1n
Мультипликация, демонстрирующая основные события мейоза: meiosis.mpg [2,65 Mb]

Мейоз разделяют на ряд стадий, которые можно различить в световой микроскоп.
Первое деление мейоза
Профаза I мейоза разделяетя на ряд стадий.
лептотена (стадия тонких нитей) начинается спирализация х-м
зиготена (стадия сливающихся нитей),сближение и начало конъюгации гомологичных х-м, кот объединяются в бивалент
пахитена (стадия толстых нитей) м-у гомологичными х-мами осуществляется кроссинговер
диплотена (стадия двойных нитей) отталкивание гомологичных х-м, кот отделяются др от др в области центромер, но остаются связанными в областях прошедшего кроссинговера – хиазмах
диакинез (стадия обособления двойных нитей) гомологичные х-мы удерживаются в месте лишь в отдельных точках хиазм – уменьшение числа хиазм, компактность бивалентов
Метафаза I - завершается формирование веретена деления, его нити прикрепляются к центромерам хромосом, в результате чего биваленты устанавливаются в плоскости экватора веретена деления, образуя экваториальную пластинку.
Анафаза I - связи в бивалентах ослабляются и гомологичные хромосомы отходят друг от друга, направляясь к противоположным полюсам веретена деления. К каждому полюсу подходит гаплоидный набор хромосом, состоящий из двух хроматид.
Телофаза I - у полюсов веретена деления собирается одинарный гаплоидный набор хромосом, каждая из них содержит удвоенное количество ДНК (n2c).
Интеркинез - временной промежуток между первым и вторым делениями мейоза. Не всегда обязателен.
Второе мейотическое отделение (эквационное) протекает как митоз, только клетки, вступающие в него, несут гаплоидный набор хромосом.

ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ МЕЙОЗА
Продолжительность мейоза напрямую зависит от количества ДНК в ядре. Также продолжительность мейоза зависит от структуры хромосомной организации и особенностей данного вида.

ПРЕМЕЙОТИЧЕСКАЯ ИНТЕРФАЗА

ПРОФАЗА I

Лептотена
(стадия тонких нитей) начинается спирализация х-м

Зиготена
Происходит начало синапсисиса - спаривание гомологичных хромосмом с образованием бивалента, или синаптонемального комплекса, в котором хромосомы выровнены и соединены.
Во время зиготены образуется zDNA составляющая 0,3, 0,4% от всей ДНК. zDNA GC-обогащена и находится в блоках длиной 104 пн разбросанных вдоль хромосом. Добавление ингибиторов синтеза ДНК в зиготене, предотвращают синапсис.

Пахитена
Хромосомы конденсируются
Синаптонемальный комплекс
Мейоз проходит и в отсутствии синаптонемального комплекса, но без рекомбинации.

Диплотена

Диакинез

МЕТАФАЗА I

АНАФАЗА I

ТЕЛОФАЗА I

ИНТЕРКИНЕЗ

ПРОФАЗА II
МЕТАФАЗА II
АНАФАЗА II
ТЕЛОФАЗА II

ГАМЕТОГЕНЕЗ

СИНАПСИС

КРОССИНГОВЕР

Alberts, 2003

Alberts, 2003

Alberts,2003

Митоз

2n-->S-->4n-->2x2n

ПРОФАЗА.
В профазе происходят следующие события: конденсация хромосом, формирование веретена деления, распад ядрышек, эндоплазматического ретикулума (ЭР), цитоплазматических микротрубочек, снижается и прекращается синтез РНК.
Каждая хромосома двойная (2x2n), они тесно соприкасаются и спирализуются одна относительно другой.
Конденсация хроматина.
После S-фазы сестринские хроматиды остаются связаны мультибелковым комплексом когезинов располагающимся вдоль хроматид в процессе их удвоения. Когезины удерживают хроматиды вместе вплоть до их расхождения в анафазе.
Первый признак Митоза – конденсация хромосом (у человека в 50 раз). Конденсины – белки участвующие в конденсации. Запуск M-Cdk фосфорилирования конденсинов отвечает за их сборку в комплексы на ДНК и конденсации хромосом. При конденсации затрачивается энергия АТФ. Хромосомы конденсируются вокруг продольной центральной оси хромосомы на которой наблюдается наибольшая концентрация конденсинов. В фиксированных препаратах наблюдается сначала спиральная укладка конденсинов вдоль хромосомы (рис.1 )

рис.1 Спиральная укладка хроматид - окраска на специфические белки показывает их спиральное расположение в хромосомах.

Конденсины и когезины структурно родственны и работают по одинаковым механизмам. Установлено, что если после S-фазы соединение хроматид не наступило правильно, то конденсация также не наступает.
Конденсины (когезины) образуют димеры антипараллельно направленные на концах которых находятся ДНК- и АТФ-связывающие домены, а на середине гибкий шарнир (рис.2).

рис.2

Когезины связывают хромосомы еще в S-фазе.
Cohesin is a four-subunit protein complex, in which a heterodimer of SMC proteins, in this case SMC1/SMC3, associates with two other proteins, the Scc1/RAD21/Mcd1 and Scc3 proteins. In vertebrates there are two variants of Scc3, called SA1 and SA2.(Jessberger 2005)
SMC (The structural maintenance of chromosomes proteins) обнаружены в бактериях и археях. В отличии от эукариотических, представляют гомодимеры, кодируемые одним геном.

рис.3 Structure of cohesin and a possible mechanism by which it might hold sister chromatids together. (A) Smc1 (red) and Smc3 (blue) form intramolecular antiparallel coiled coils, which are organized by hinge or junction domains (triangles). Smc1/3 heterodimers are formed through heterotypic interactions between the Smc1 and Smc3 junction domains. The COOH terminus of Scc1 (green) binds to Smc1's ABC-like ATPase head, whereas its NH2 terminus binds to Smc3's head, creating a closed ring. Scc3 (yellow) binds to Scc1's COOH-terminal half and does not make any direct stable contact with the Smc1/3 heterodimer. Scc1's separase cleavage sites are marked by arrows. Cleavage at either site is sufficient to destroy cohesion. By analogy with bacterial SMC proteins, it is expected that ATP binds both the Smc1 and Smc3 heads, alters their conformation, and possibly brings them into close proximity. By altering Scc1's association with Smc heads, ATP binding and/or hydrolysis could have a role in opening and/or closing cohesin's ring. (B) Cohesin could hold sister DNA molecules together by trapping them both within the same ring. Cleavage of Scc1 by separase would open the ring, destroy coentrapment of sister DNAs, and cause dissociation of cohesin from chromatin. (C) Smc-containing complexes other than cohesin could also function via chromatid entrapment. Condensin, for example (black), could organize mitotic chromosomes by trapping supercoils. It and/or other related complexes could hold distant loci together (arrow) and thereby facilitate the function of long-range enhancers and silencers of transcription.

Образование веретена деления
В микротрубочках веретена ~10^8 молекул тубулина. Веретено нормально функционирует при разрушении центриолей лазером. Центром организации микротрубочек служит аморфное вещество центросомы.
Микротрубочки растут от центросом, белки диненины связывают перекрывающиеся микротрубочки, которые продолжают расти и расталкиваются кинезинами, при этом полюса расходятся. В это время микротрубочки с кинетохором не связываются.
Число микротрубочек прикрепленных к кинетохорам различно у разных видов – у некоторых грибов – 1микротрубочка, у человека - 20-40.
Остаточное тельце – фрагменты полюсных микротрубочек+плотный матрикс.
После начала митоза центросомы расходятся и каждая образует радиально симметричный центр организации микротрубочек (астра). Центросома расположена у ядра. Две астры двигаются к противоположным сторонам ядра для формирования двух полюсов веретена деления. Когда ядерная оболочка разрушается (прометафаза) веретено захватывает хромосомы. В клетках эмбрионов Xenopus центросома удваивается даже если ядро было передвинуто, или репликация ДНК подавлена. Центросомный цикл продолжается почти нормально: сначала 2, потом 4, 8 центросом и т.д. На ооцитах Xenopus было показано, что G1/S-Cdk (комплекс cyclin E и Cdk2) инициирует ДНК репликацию в S фазе также стимулирует удвоение центросомы, это предположительно объясняет почему удвоение центросом происходит в начале S-фазы
Рост веретена зависит от моторных белков принадлежащих к двум семействам – kinesin-related proteins движущиеся к ‘+’
концу и денеины, движущиеся к ‘–‘. Три типа микротрубочек наблюдаются в веретене – астральные, кинетохорные, перекрывающиеся-создают правильную структуру веретена. Микротрубочки растут от центросомы вперед ‘+’ концом. Три вида микротрубочек различаются поведением и наборами присоед белков.
Веретено начинает собираться в профазе. M-Cdk запускают фосфорилирование двух типов белков контролирующих динамику микротрубочек. Типы: моторные белки и microtubule-associated proteins (MAPs). Также имеются белки катастрофины.
В интерфазе микротрубочки отходят от одной центросомы и находятся в динамическом равновесии. Переключение ведущее к росту называется спасение, переключение к уменьшению микротрубочек – катастрофа. В профазе длинные интерфазные микротрубочки быстро преобразуются в множество коротких окружающих каждую центросому, которые начинают формировать веретено деления.

РАСПАД ЭР
ЭР распадается на мелкие вакуоли, лежащие по переферии клетки и Аппарата Гольджи (АГ), который теряет околоядерную локализацию, разделяется на отдельные диктиосомы разбросанные в цитоплазме.

ПРОМЕТАФАЗА
Распад ядерной оболочки, беспорядочное движение хромосом в области бывшего ядра, хромосомы через кинетохор соединяются с веретеном и начинают движение.

Распад ядерной оболочки

Кинетохор
Sc: кинетохор связан с цетромерным локусом CEN: CDEI,II,III. CDEI,III – консервативные районы сходны с Dm. CDEII – обогащен АТ, участок разной длины. CDE ответственен за связь с мт, взаимодействует с рядом белков.
кинетохор – мультибелковый комплекс, состоит из трех слоев:
наружный – плотный (СENP-E, СENP-F – участвуют в связывании мт), от него отходит множество фибрилл – фиброзная корона кинетохора (СENP-E, динеины)
средний – рыхлый, 3F3/2 – белок, регистрирует натяжение пучков мт
внутренний – плотный, участок ГХ обогащенный а-сателлитной ДНК (СENP-B- связывается с а-ДНК, MCAK-кинезинподобный белок-когезин, INCENP-когезин, СENP-А-аналог H3, СENP-G-связывается с белками ядерного матрикса, СENP-С-ф-ция не выяснена)
Функция кинетохора: связывание хроматид, закрепление мт веретена.
min число мт у Sc 1 на хромосому, у высших растений 20-40 мт на хромосому
белки кинетохора присутствуют во всех стадиях кц, образование и деление кх происх в S-периоде
Х-мы беспорядочно движутся – метакинез – то приближаются к полюсам, то удаляются к центру веретена, пока не займкт среднее положение – конгрессия х-м. мт случайно захватываются кинетохором и х-мы скользят по мт к полюсу 25мкм/мин, с помощью аналога динеина. Во время движения мт не разбираются. Хроматиды связаны и тянутся с двух сторон. Если лазером перерезать мт с одной стороны, то х-мы утянуться к противоположному полюсу
Перемещение хромосом к экватору
если митотич кл обработать D2O или таксолом – подавляют разборку мт?мт удлиняются и не тянут хромосомы?блок митоз
колхицин, низкая t, высокое гидростатич давление – разрушение нитей веретена?блок митоз
сила действующая на кинетохорную нить тем слабее чем ближе к полюсу нах кинетохор

МЕТАФАЗА
Завершается формирование веретена деления, хромосомы перестают двигаться и выстраиваются по экватору веретена (экваториальная пластинка)
метафаза - синтез белка – 20-30% от интерфазы. Клетки наиболее чувствительны к холоду, колхицину и др. агентам, которые разрушают веретено деления и приводят к прекращению митоза (К-митоз), при малых дозах митоз восстанавливается через несколько часов (иначе гибель либо полиплоидия).
Метафаза – хромосомы образуют пластинку, микротрубочки достигают max концентрации и перекрываются.

АНАФАЗА
Анафаза – хромосомы внезапно одновременно отделяются друг от друга и начинают движение к полюсам. Центромеры разъединяются – деградация центромерных когезинов. Наиболее короткая стадия, разделение хроматид и расхождение хромосом к полюсам (v=0,2-5 мкм/мин). Иногда также расходятся полюса друг от друга.
Расхождение хромосом за счет кинетохорных пучков микротрубочек – анафаза А, расхождение хромосом вместе с полюсами за счет удлинения межполюсных микротрубочек – анафаза В.
Разделение хроматид и движение к полюсам.
Веретено и перетяжка связаны так, что пока хромосомы не разойдутся перетяжка цитоплазмы не наступает.
События анафазы: движение кинетохорных нитей к полюсам, движение полюсных нитей расталкивающих полюсы-движутся друг относительно друга; малые дозы хлоралгидрата предотвращают удлинение и движение полюсных нитей, но не влияют на кинетохорную нить.

ТЕЛОФАЗА.
Телофаза длится с момента прекращения движения хромосом. Происходит реконструкция ядер - образование ядерной оболочки, деспирализация хромосом, активация хромосом - увеличение уровня транскрипции, формирование ядрышек, разрушение веретена деления, разделение клеток, образование остаточного тельца Флеминга, образование перетяжки.
В местах контактов хромосом с мембранными пузырьками начинает образовываться ядерная оболочка. Сначала она образуется на латеральных поверхностях хромосом, затем в центромерных и теломерных участках. После смыкания ядерной оболочки происходит образование ядрышек.
Разборка микротрубочек идет от полюсов к экватору бывшей клетки, в средней части веретена микротрубочки сохраняются дольше всего – остаточное тельце.
Цитокинез.
Борозда деления образуется в плоскости метафазной пластинки под прямым углом к длинной оси митотического веретена. Перетяжка содержит актиновые филаменты и миозин II, расположенные по экватору делящейся клетки под плазматической мембраной (ПМ) стягивая ее изнутри.
Одной из причин почему цитокинез не происходит раньше окончания митоза является активность M-Cdk инактивируемой в конце митоза.

ИНТЕРФАЗА.

Основные сведения

Размеры клеточных структур

Введение

Размеры клеток и клеточных структур

В обычной жизни мы не привыкли рассматривать объекты малых размеров, и представить и сопоставить относительные размеры клеток и субклеточных структур бывает довольно сложно. В таблице ниже представлены размеры различных клеток, органел, вирусов и биохимических молекул. В правом столбце таблицы представлены размеры, для того чтобы было удобно сравнивать между собой различные структуры в привычном нам масштабе. В таком увеличении 1 мкм будет равен 10 см, и довольно крупная эукариотическая клетка будет размером с ваш письменный стол, а все органеллы и молекулы можно легко сравнивать, если мысленно расположить их на этом столе.

Ограничение размеров клетки

1. Необходимое для жизнедеятельности количество макромолекул
2. С увеличением объемов клетки скорости химических реакций ограничиваются скоростью диффузии молекул.
3. Оптимальное соотношение S/V. При увеличении размеров клеток объем возрастает гораздо быстрее, чем площадь поверхности, что приводит к резкому уменьшению числа молекул питательных веществ на единицу объема, проникших в клетку за единицу времени. Существование диффузионных ограничений объясняет, почему эукариотические клетки крупнее, чем прокариотические: цитоплазма эукариотических клеток разделена мембранами на компартменты в значительной мере для того, чтобы облегчить возможность быстрых взаимодействий между молекулами.
Растительные клетки крупнее животных, во-первых, из-за присутствия крупной центральной вакуоли, которая сама является довольно химически инертным компартментом, тогда как объем цитоплазмы растительной клетки относительно невелик, и, во-вторых, из-за осуществления циклоза - активного движения цитоплазмы, снижающего диффузионные ограничения.
Особые случаи большого размера клеток наблюдаются когда клетка не осуществляет активные химические превращения, а служит просто как резервуар для запасания и хранения веществ – яйцеклетки, клетки мякоти плодов.
Увеличение размеров клеток благодаря многократному повторению внутренних элементов клеточной структуры. Например, многоядерность увеличивает концентрацию молекул информационных РНК в цитоплазме и позволяет многоядерным клеткам быть крупнее одноядерных, поскольку снижает ограничения, связанные с диффузией РНК из ядра.
Повторения внутренних структурных элементов часто приводят к увеличению длины клеток при сохранении их микроскопического диаметра (например, у животных мышечные клетки длиной до нескольких см, нервные клетки с отростками длиной до 1 м, а у растений клетки флоэмы длиной до 5 мм).

Соотношение объемов клеточных структур (гепатоцит)

Отличие прокариот и эукариот

к прокариотам относятся цианеи, актиномицеты, все бактерии, микоплазмы,
риккетсии и вирусы

Отличие животных, растений и грибов

Список дифференцированных клеток человека

клеток в человеке ~10¹⁴.

Ороговевающие эпителиальные клетки
кератиноцит эпидермиса (= диф. эпидермальная клетка)
базальная клетка эпидермиса (стволовая)
кератиноцит ногтей
базальная клетка ногтевого ложа (стволовая)
клетки стержня волоса
клетка мозгового в-ва
клетка коркового в-ва
кутикулярная клетка
клетки корневого влагалища волоса
кутикулярная
слоя Гексли
слоя Генле
наружная
клетка волосяной матрицы (стволовая)
Клетка влажных многослойных барьерных эпителиев
поверхностная эпителиальная кл. многослойного чашуйчатого эпителия языка, ротовой полости, пищевода, анального отверстия, дистальной части уретры, влагалища
Базальная клетка тех же видов эпителия (стволовая)
Клетка наружного эпителия роговицы
Клетка эпителия мочевыводящих путей (выстилающего моч. пузырь и др.)
Эпителиальная клетка с экзокринной ф-цией
клетки слюнной железы
слизистая клетка (секрет богат полисахаридами)
белковая клетка (секрет богат гликопротеиновыми ф-тами)
клетки железы фон Эбнера в языке (сек-т для промывания вкусовых почек)
клетка молочной железы секретирующая молоко
к-ка слезной железы, секретирующая слезы
Клетки секретирующие гормоны
клетки передней доли гипофиза, выделяющие
гормон роста

фолликулостимулирующий гормон
лютеинизирующий гормон
адренокортикотропный гормон
тиреотропный гормон
к-ка промежуточной доли гипофиза, выделяющая меланоцитстимулир. г.
к-ки задней доли гипофиза, выделяющие
окситоцин
вазопрессин
клетки желудочно-кишечного тракта, секретирующие
серотонин
эндорфин
соматостатин
гастрин
секретин
холецистокинин
инсулин
глюкагон
клетки щитовидной железы, секретирующие
тиреоидный гормон
кальцитонин
клетки паращитовидной железы
секретирующие паратгормон
оксифильные клетки (ф-ция неизвестна)
клетки надпочечников, секретирующие
адреналин
норадреналин
стероидные гормоны
минералокортикоиды
глюкокортикоиды
клетки половых желез, секретирующие
тестостерон (клетки Лейдига в семенниках)
эстроген (клетки theca interna яйцевого фолликула в яичниках)

прогестерон (клетки желтого тела)
клетки юкстагломерулярного аппарата почки
юкстагломерулярные клетки (секретируют ренин)
клетки macula densa
периполярные клетки
мезангиальные клетки
Эпителиальные всасывающие клетки жкт, экзокринных желез и мочеполовых путей
клетка со щеточной каемкой из микроворсинок (в тонком кишечнике)
исчерченная клетка протока экзокринной железы
эпителиальная клетка желчного пузыря
клетка со щеточной каемкой в проксимальном почечном канальце
клетки дистального почечного канальца
безресничная клетка семевыносящего протока
клетки эпидермиса
главная клетка
базальная клетка
Клетки ответственные за процессы метаболизма и накопление резервных материалов
гепатоцит (печеночная клетка)
жировые клетки
клетка белого жира
клетка бурого жира
липоцит печени
Эпителиальные клетки, с барьерной ф-цией – выстилающие легкие, кишечник, экзокринные железы и мочеполовой тракт
пневмоциты типа I (выстилающие воздушную полость легкого)
клетка протока поджелудочной железы (центроацинарная клетка)неисчерченная к-ка протока потовой железы, слюнной , молочной ж. и др.
париетальная клетка почечного клубочка
подоцит почечного клубочка
клетка тонкой части петли Генле (в почках)
клетка собирательной трубочки (в почках)
клетки протока семенного пузырька, предстательной железы и т.д.
Эпителиальные клетки, выстилающие замкнутые внутренние полости
клетки эндотелия кровеносных и лимфотических сосудов
фенестрированная
непрерывная
селезеночная
синовиальные клетки (выстилающие суставные полости и секретирующие главным образом гиалуроновую к-ту
серозные клетки
чешуйчатые клетки, выстилающие перилимфотическое пр-во уха
клетки, выстилающие эндолимфотическое пр-во уха
чешуйчатая клетка
столбчатая клетка эндолимфотического мешочка
с микроворсинками
без микроворсинок
темная клетка
клетка вестибулярной м-ны (напоминает кл-ку сосудистого сплетения)
базальная клетка сосудистой полоски (stria vascularis)
маргинальная клетка сосудистой полоски
клетка Клаудиуса
клетка Бётчера
клетка сосудистого сплетения (сек-ющая цереброспинальную жидкость)
чешуйчатая клетка мягкой и паутинной об-к
клетки ресничного эпителия глаза
пигментированные
непигментированные
«эндотелиальная» клетка роговицы
Ресничные клетки
клетки дыхательных путей
клетки яйцевода и эндометрия (у женщин)
клетки (rete testis) и семевыносящего протока (у мужчин)
эпиндимальные клетки, выстилающие полости мозга
Клетки, секретирующие внеклеточное вещество эпителиальные
амелобласты (секретируют зубную эмаль)
клетки planum semilunatum
вестибулярного аппарата (сек-т протеогликан)
интердентальные клетки кортиева органа (сек-т в-во текториальной м-ны, лежащей над волосковыми клетками этого органа)
неэпителиальные (соединительнотканные)
фибробласты (рыхлой соединительной ткани, роговицы, сухожилий, ретикулярной ткани костного мозга)
перицит кровеносного капилляра
клетка nucleus pulposus межпозвоночного диска
цементобласт (цементоцит) (сектетирует цемент корня зуба)
одонтобласт (одонтоцит) (секретирует дентин зуба)
хондроциты
гиалинового хряща
волокнистого хрящаэластичного хрящаостеобласт (остеоцит)
первичная остеогенная клетка (стволовая клетка остеобластов)
гиалоцит стекловидного тела глаза
звездчатая клетка перилимфатического пространства уха
Сократимые клетки
клетки скелетных мышц
красные (медленные)
белые (быстрые)
промежуточные
мышечное
веретено с ядерной сумкой
мышечное веретено с ядерной цепочкой
клетки-сателлиты (стволовые клетки)
клетки сердечной мышцы
обычные
узловые (пейсмейкерные)
волокна Пуркинье
клетки гладких мышц (разные)
миоэпителиальные клетки
радужной оболочки
экзокринных желез
Клетки крови и иммунной системы
эритроцит
мегакариоцит
макрофаги
моноцит
макрофаги соединительной ткани (разные)
клетка Лангерганса (в эпидермисе)
остеокласт (в кости)
дендритная клетка (в лимфоидных тканях)
микроглиальная клетка (в цнс)
нейтрофил
эозинофил
базофил
тучная клетка
Т-лимфоциты
т-хелпер
т-супрессор
т-киллер
В-лимфоциты
IgM
IgG
IgA
IgE
клетка-киллер
стволовые клетки крови и иммунной системы (разные)
Сенсорные клетки
фоторецепторы
палочки
колбочки
чувствительные к синему
чувствительные к зеленому
чувствительные к красные
слуховые рецепторные клетки
внутренние волосковые клетки кортиева органа
наружные волосковые клетки кортиева органа
рецепторы ускорения и силы тяжести
волосковые клетки вестибулярного аппарата
тип I
тип II
вкусовые рецепторные клетки
клетки вкусовой луковицы, тип II
обонятельные рецепторные клетки
обонятельный нейрон
базальная клетка обонятельного эпителия (стволовая)
рецепторы pH крови
клетки каротидного тельца
тип I
тип II
осязательные рецепторные клетки
клетка Меркеля в эпидермисе
первичные осязательные нейроны (разные)
терморецепторные клетки
первичные терморецепторные нейроны
чувствительные к холоду
чувствительные к теплу
болевые рецепторы
первичные нейроны, чувствительные к боли (разные)
рецепторы положения
и напряжения в скелетно-мышечной сис-ме
первичные проприоцептивные нейроны (разные)
Вегетативные нейроны
холинэргические (разные)
адренэргические (разные)
пептидэргические (разные)
Опорные клетки органов чувств и периферических нейронов
Опорные клетки кортиева органа
внутренняя столбчатая клетка
наружная столбчатая клетка
внутренняя фаланговая клетка
наружная фаланговая клетка
пограничная клетка
клетка Генсена
опорная клетка вестибулярного аппарата
опорная клетка вкусовой почки (клетка вкусовой почки, тип I)
опорная клетка обонятельного эпителия
шванновская клетка
клетка сателлит (инкапсулирующая тела периферических нейронов)
глиальная клетка кишечника
Нейроны глиальных клеток
нейроны (много плохоклассифицированных типов)
глиальные клетки
астроциты (разные)
олигодендроцит
Клетка хрусталика
эпителиальная клетка передней части хрусталика
волокно хрусталика (клетка, содержащая кристаллины)
Пигментные клетки
меланоцит
эпителиальная кл-ка пигментного слоя сетчатки
Половые клетки
ооцит
сперматоцит
сперматогония (стволовая клетка сперматозоидов)
Питающие клетки
клетка овариального фолликула
клетка Сертоли (в семеннике), эпителиальная клетка тимуса
(Альбертс, 1994)

Микротрубочки

Параметры микротрубочек

Время полужизни микротрубочки ~5 мин, во время первой половины митоза ~15c
Диаметр микротрубочки 25нм.

Образование микротрубочек

Структурной единицей микротрубочки является гетеродимер белка тубулина, состоящий из α- и β-субъединиц (53 и 55 кДа), не прибывающих по отдельности, схожие но не идентичные. Каждая из субъединиц имеет сайт для связывания нуклеотида. α-тубулин связывает молекулу GTP, которая не гидролизуется, β-тубулин может связывать GDP или GTP (рис.1). β-тубулин одного гетеродимера связывает GTP и соединяется с α-тубулином другого гетеродимера, при этом GTP гидролизуется до GDP. α-тубулин является GTP-активирующим белком и катализирует гидролиз GTP β-тубулина (рис.2). Таким образом гетеродимеры образуют линейные цепочки – протофиламенты, 13 протофиламентов образуют спиральный циклический комплекс, такие кольца полимеризуются в трубку (рис.3). Фосфорилирование тубулина усиливает полимеризацию.

рис.1 Гетеродимер тубулина. α-тубулин (син.) с сайтом связывания GTP (голуб.). β-тубулин (зел.) с сайтами связывания GTP и GDP (красн.)
Микротрубочки - динамические полярные стр-ры. (+)-конец динамически нестабильный (β-тубулин) и (-)-конец стабилизируется, связываясь с центром организации микротрубочек (см. обзор Центросома).
Тредмиллинг - движение микротрубочек в результате одновременного наращивания одного конца и диссоциации другого конца микротрубочек.
ДНК тубулина в нуклеотид-связывающем домене имеет высококонсервативную последовательность GGGTG(T/S)G.
Бактериальный белок FtsZ - гомолог тубулина является компонентом бактериального цитоскелета и полимеризуется с образованием микротрубочек.

Микротрубочки

рис.2 Микротрубочки способны образовывать синглет, дублет и триплет.
A микротрубочка дублета или триплета состоит из 13 протофиламентов.
Трубочки B и C состоят из меньшего числа протофиламентов, обычно 10.

Белки соединяющиеся с микротрубочками.


С микротрубочками ассоциируют два вида белков: структурныерные
белки (MAP-microtubuls-associated proteins) и белки транслокаторы.

Присоединение MAP регулируется фосфорилированием, в результате
которого некоторые MAP отсоединяются от микротрубочек.

+TIPS - белки взаимодействующие с (+)-концом
микротрубочки, многие из которых являются моторными белками,
другие обеспечивают взавимодействие с микрофиламентами в
клеточном кортексе, присоединяя микротрубочки к плазматической
мембране. Некоторые +TIPS регулируют динамику микротрубочек
и стабильность (+)-конца, например, XMAP215
семейство белков стабилизирует (+)-конец предотвращая разрушение
и обеспечивая рост микротрубочек.

CLASP - белки обеспечивающие присоединение
димеров тубулина к (+)-концу и ингибируют катастрофины.
Они взаимодействуют с кинетохором - комплексом который соединяет
(+)-конец микротрубочки с хромосомой.

Катастрофины - +TIP белки связывающиеся с (+)-концом микротрубочек
и обепечивающие диссоциацию димеров тубулина. Они способны
активировать гидролиз GTP или изменение конформации протофиломентов
(MCAK - кинезин, располагающийся в кинетохоре
и обеспечивает диссоциацию (+)-конца во время анафазы митоза).

Стасмин - дестабилизирующий белок, находящийся
в раковых клетках. Присоединяется с тубулиновым гетеродимером
затрудняя их полимеризацию. Стасмины ингибируются фосфорилированием.

Катанин - разделяет микротрубочки образуя новый нестабильный
(+)-конец.

НекоторыеMAP соединяют микротрубочки
друг с другом, с мембраной или промежуточными филаментами.


Тип I MAP обнаружен в аксонах и дендритах нервных клеток
и некоторых других имеет несколько повторов KKEX (Lys-Lys-Glu-X)
которые связывают (-)-заряженные участки тубулина.

Тип II MAP также обнаружен в аксонах и дендритах нервных
клеток и некоторых других. Они имеют 3-4 повтора из 18 остатков
последовательности, которая присоединяет тубулин.

Белки взаимодействующие с (+)-концом микротрубочек

APC, Kar9 (Sc)*

APC (adenomatous polyposis coli) - опухолевый супрессор,
являющийся основой для белкового комплекса регулирующего
фосфорилирование b-катенинов.

EB1, Bim1(Sc), Mal3 (Sp)

EB1 (end-binding protein 1) - белок взаимодействующий с
APC.

Nud (An)

Nud (nuclear distribution) - белок регулирующий динеины.

Lis1/NUDF (An), Pac1 (Sc)

Lis (lissencephaly) - нарушение развития человеческого мозга
(гладкий мозг). Белок взаимодействует с динеином регулируя
его функцию.

NUDE (An), R011 (Neurospora
crassa)/Ndl1 (Sc); Nde1, Ndel1
(млекопитающие).

Эти белки взаимодействуют с Lis1 и денеинами и обеспечивают
их функционирование.

Kar3 (Sc)

Kar3 - кинезин, имеющий C-концевой моторный домен и пренадлежит
к семейству Kinesin-14.

Kip2(Sc), Tea2
(Sp), KipA (An)

Кинезины грибов принадлежащие семейству Kinesin-7 включающее
CENP-E - центромерный белок млекопитающих, Kip2 , Tea2 and
KipA

Klp10A (Dm), Klp59C, MCAK

Члены семейства Kinesin-13. Klp10A - предполагаемый гомолог
Kif2A млекопитающих. Klp59C (Dm) - предпоплагаемый гомолог
MCAK млекопитающих. KLP10A и другие члены Kin I
субсемейства кинезинов взаимодействующих с некепированным
(-)-концом микротрубочек веретена деления во время митоза.
Они обеспечивают диссоциацию тубулиновых димеров полюсов
клетки, способствуя тедмиллингу (движению
микротрубочек к полюсам и укорочение микротрубочек во время
анафазы митоза).

Dynactin

Комплекс белков включающий белок p150glued. Динактин связывает
динеин и регулирует его свойства, а такжи присоединяет везикулы
к динеину. p150glued - гомолог NUDMA. nidulans.

CLIP-170, Bik1 (Sc), Tip
(Sp)

CLIP-170 обеспечивает стабилизацию и рост микротрубочек,
а так же регулирует локализацию динеина.

СLIP-170 - обеспечивает посадку комплекса динеин-динактин,
участвующего в транспорте везикул, на конец микротрубочки.
LIP-170 находится в цитоплазме в неактивной конформации
в которой N-конец связывающийся с микротрубочкой связан
с С-концом той же молекулы. При связывании N-конца с тубулином
или (+)-концом микротрубочки, C-конец освобождается и связывается
с комплексом динеин-динактин через молекулу p150Glued, микротрубочка
стабилизируется. Диненин-динактин освобождается и начинает
движение вдоль микротрубочки (рис.3)

Некоторые токсины и лекарства, некоторые из которых нарушают митоз влияют на полимеризацию и деполимеризацию тубулина:
таксол - противоопухолевое лекарство, стабилизирует микротрубочки.
колхицин связывает тубулин блокируя полимеризацию. Микротрубочки деполимеризуются при высокой концентрации колхицина.
винбластин - усиливает деполимеризацию образуя паракристаллы винбластин-тубулин.
нокодазол - обеспечивает деполимеризацию микротрубочек.
Ассоциация подавляется винбластин, винкристин, колхицин, усиливается – таксол.
Гамма-сома – центр организующий микротрубочки на внешней поверхности ядра.

Микрофиламенты

G-актин

мономер G-актин (глобулярный актин)- ассиметричный
(42кДа) состоит из двух доменов, по мере повышения ионной
силы агрегирует в скрученный в спираль полимер F-актин (фибриллярный
актин).

G-актин имеет участки связывания двухвалентных катионов
и нуклеотидов в физиологических условиях занятые Mg²⁺
и ATP.

Полимеризация G-актина в F-актин

F-актин обладает полярностью (+) и (-) имеющих
различные свойства.

Молекула G-актина несет прочно связанную АТФ, который при
переходе в F-актин медленно гидролизуется до АДФ – проявляет
свойства АТФ-азы Полимеризация сопровождается гидролизом
АТФ, что не необходимо т.к. полимеризация идет и в присутствии
негидролизуемых аналогов АТФ

Полимеризация состоит из нескольких процессов: нуклеация,
элонгация, диссоциация,
фрагментация, стыковка.
Эти процессы протекают одновременно.

Нуклеация – соединение трех G-актинов –
инициация полимеризации.

Элонгация - наращивание цепи актина путем
присоединения G-актина к (+)-концу F-актина.

Диссоциация - укорачивание цепи. Деполимеризация
актина имеет одинаковую скорость с обоих концов

Фрагментация - в результате теплового движения
F-актин может фрагментироваться.

Стыковка - отдельные фрагменты могут соединяться
друг с другом конец в конец.

При конценрации G>F – одновременно происходит полимеризация
(+) и (–) конца.

Если G<F – происходит полимеризация (+) и деполимеризация
(–)-конца – тредмиллинг – движение F-актина
за счет одновременного наращивания (+)-конца и диссоциации
(-)-конца. При G ~ F – динамическое равновесие - происходит
полимеризация (+) и деполимеризация (–)-конца с затратой
энергии ATP G-актин связ с ATP и полимеризуясь гидролизует
ATP.при критических конц G-актина (+) конец удлиняется,
а (-) – укорачивается

Актиновые микрофиламенты

F-актин – фибриллярный, длина оборота спирали 37
нм, d=6-8нм.

Актинсвязывающие белки

Более 50 белков в цитоплазме связываются с актином выполняя
различные функции: регулируют объем G-актинового пула (профилин),
влияют на скорость полимеризации (виллин), стабилизируют
концы нитей (фрагин, а-актинин), сшивают филаменты др с
др или с др компонентами (виллин, α-актин, спектрин,
MARCKS, фимбрин), разрушают двойную спираль F-актина (гельзолин).
Активность этих белков регулируется Ca²⁺ и протеинкиназами.

Имеется пять мест действия белков: с мономером
актина, с (+)-концом (оперенный), с (-)-концом (заостренный),
с боковой поверхностью. Актин-связывающие белки могут быть
чувствительны или нечувствительны к Ca²⁺

1. Белки связывающиеся c мономером актина - подавляют нуклеацию
(профилин, фрагментин - чувствительны к Ca²⁺).
Профилин с мономером способны надстраивать F-актин, а фрагментин
нет, блокируя и нуклеацию и элонгацию. Не чувствительные
к Ca²⁺ ДНКазаI и белок связывающийся с витамином
D - функционируют вне клетки.

2. Кепирующие(+)-конец может быть блокирован кепирующими
белками - блокирование элонгации и стыковки, способствуют
нуклеации - появление укороченных филаментов (гельзолин,
виллин, фрагмин)

3. (-)-конец - инициирование нуклеации, подавление стыковки
и элонгации - увеличение числа и уменьшение длины фрагментов.
Акументин в макрофагах, бревин - сывороточный белок вызывает
быстрое снижение вязкости раствора F-актина. Оба белка не
чувствительны к Ca²⁺

4. Не сшивающие - боковое связывание может как стабилизировать
так и дестабилизировать F-актин Тропомиозин (Ca-независим)
стабилизирует, северин, виллин (Ca-зависим) - связываясь
с F-актином разрезают его.

5. Сшивающие F-актин между собой с образованием геля. Такие
белки индуцируют нуклеацию. Такие белки димерны или имеют
два актин-связывающих домена. α-актин тромбоцитов,
виллин, фимбрин, актиногелин из макрофагов (Ca-независим).



кэпирующие белки - закрывают концы актиновых
филаментов, предотвращая полимеризацию-деполимеризацию,
способствуют прикреплению филамента к мембране.

фаллоидин – яд бледной поганки, связывается
с (-)-концом и ингибирует деполяризацию.

цитохалазин – токсин плесневых грибов присоединяется
к (+) концу, блокируя полимеризацию.

кэпирующие-фрагментирующие белки - фрагментируют
F-актин, вызывая переход геля в золь (гельзолин 90kD активируясь
Ca2+ 10-6M разрывает F-актин и связывается с его концами).



белки связывающие F-актин

Структуры образуемые актином

Клеточный кортекс – сеть из актиновых филаментов
под плазматической мембраной.

Филлоподии

Стресс-фибриллы - образуются, когда у клетки есть
возможность прикрепиться к субстрату

Промежуточные филаменты

ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ФИЛАМЕНТЫ
белки промеж филаментов клетки число M, kD тип
кислые кератины эпит >15 40-57 I
основные кератины эпит >15 53-67 II
десмин мыш 1 53 III
кислый фибриллярный белок глиальн, астроциты 1 50
виментин мезенх, нек эпит 1 57
периферин нервные 1 57
белки нейрофиламентов: аксоны и дендриты IV
NF-L 1 62
NF-M 1 102
NF-H 1 110
интернексин ЦНС 1 66
нестин эпит нервн ткани 1 240
ламин A ядра всех клеток 1 70 V
ламин B 1 67
ламин С 1 67
септамерный мономер?параллельный димер?антипараллельный тетрамер?протофиламент? протофибрилла?ПФ
промежуточные филаменты
d=10нм, (цитокератины, десмин, виментин, кислый фибриллярный глиапротеин (GFAP), нейрофиламент) состоят из базовой стержневой стр-ры – суперспирализованная -спираль, такие димеры ассоциируют антипараллельно, образуя тетрамер, агрегация тетрамеров «голова к голове» дает протофиламент, 8 протофиламентов образ. промежуточное волокно | полимеризация ведет к образ. устойчивых неполярных полимерных молекул

белки связанные с ПФ
белок M, kD локализация
BPAG1 230 полудесмосомы
плакоглобин 3 десмосомы
десмоплакинI 250 десм
десмоплакинII 215 десм
плектин 300 кортек. зона
анкирин 140 кортек. зона
филаггрин 30 цитозоль
рецептор B-ламина 58 ядро
У мутантов мышей отсутствует виментин, мыши при этом живут совершенно нормально.
В растительных клетках цитоскелет представлен микротрубочками и микрофиламентами, промежуточных филаментов нет, но есть ламины

Реснички

Ресничка - вырост цитоплазмы h=300нм, покрытый пм
аксонема – d=200нм, 9 дублетов микротрубочек, 100, 2 центральные микротрубочки, А-микротрубочка - 13 субъединиц, В-микротрубочка – 11 субъединиц,
базальное тельце - погружено в цитоплазму d = 200 нм, 9 триплетов микротрубочек, имеет ручки, втулку и спицы в проксимальной части.
Скорость движения клеток за счет ресничек может достигать ~5мм/c. Число ресничек в кл трахеи ~300, в клетке инфузории ~14тыс.
кинетоцилии – способные к движению (эпителии, спермии), первичные реснички – не двигаются.

Основные сведения

В состав ядра входит ядерная оболочка, хроматин, ядрышко, ядерный белковый матрикс, нуклеопротеидные комплексы, кариоплазма.
В ядрах не происходит синтеза белков

рис. [577K] Ядро клетки. Видны наружная и внутренняя мембраны, темный гетерохроматин и зернистый светлый эухроматин.

рис. [213K] Ядро клетки имеет многочисленные выросты, что свидетельствует, наряду с развитым эндоплазматическим ретикулумом, о высоком уровне метаболизма клетки.

Ядерная оболочка

Ядерная оболочка - мембранный барьер, отделяющий ядро от цитоплазмы. Она контролирует перемещение макромолекул между нуклеоплазмой и цитозолем, участвует в заякоревании хромосом и цитоскелета, являясь частью регуляторного механизма экспрессии у эукариот.
Мутации в белках ядерной оболочки проявляются в виде различных заболеваний, таких как мышечная дистрофия, нейропатия, липидодистрофия, преждевременное старение (см. обзор Синдром преждевременного старения).
В состав ядерной оболочки входят мембрана, ядерный поровый комплекс и ламина.
Ядерная оболочка образована внешней и внутренней мембранами. Наружная мембрана переходит в шероховатый эндоплазматический ретикулум, и обеспечивает присоединение структурных элементов цитоплазмы. Вутренняя выстлана белками – ламининами, образующими ядерную пластинку, которая закрепляет различные ядерные структуры. Между мембранами располагается перинуклеарное пространство.

В состав ядерной оболочки также входит поровый комплекс (см. обзор Ядерный поровый комплекс).

Ламина представляет собой густую сеть выстилающую внутреннюю мембрану изнутри и состоящую из промежуточных филаментов - ламинов и взаимодействующих с ними белков. Ламина необходима для сохранения целостности ядра.
Ламина – структура и образованная белками ламинами А, B, C. A и C – производные одного гена образующиеся при альтернативном спайсинге. Ламин А содержит 113 добавочных аминокислот. Ламин В связан с липидным слоем изопрениловым якорем. Три ламины образуют димеры, имеющие стержневидный домен из а-спиралей и глобулярные домены на каждом конце. Эти домены полимеризуются и образуют сетеподобную структуру.

Ядерный поровый комплекс

Микрофотография ЯПК

Ядерный поровый комплекс (ЯПК) – восмиугольный цилиндр в состав которого входит ~100-200 белков, М=124x106 D.| Молекулы M<9kD свободно проходят через водный канал ЯПК, молекулы M>9kD перемещаются путем активного транспорта используя ядерный сигнал с затратой энергии ГТФ. Ламина связана с липопротеиновым комплексом внутренней ядерной мембраны. Импортин – белок 60kD узнает сигнальную последовательность из 6 аминокислот - PPKKKKAKV в полипептиде который транспортирует через ядерную оболочку. В ядерном импорте участвуют различные цитоплазматические факторы. ядерные поры – d=7 нм небольшие белки легко проникают в ядро; белки >40 кДа проникают, если содержат сигнальную последовательность.

В начале профазы киназы фосфорилируют ламину, которая разрушается, липопротеиновый комплекс ядерной мембраны распадается на везикулы, наружная мембрана сливается с ЭР, содержимое ядра распределяется в цитозоле. В поздней анафазе цитоплазматические фосфатазы дефосфорилируют ламины, которые полимеризуются на поверхности хромосом, везикулы сливаются образуя ядерную оболочку.
Биосинтез NAD+ -предшественник кофермента, никотинамидмононуклеотид НАМ (NMN) синтезируется в цитоплазме и транспортируется в ядрышко для превращения в динуклеотид NAD+, который после этого возвращается в цитоплазму.

ЯПК - белковый комплекс массой ~125 МДа у метазой и ~66 МДа у грибов, состоящий примерно из 30 различных белков, называемых нуклеопорины.
review 17-19, 26-30. Нуклеопорины разделяют на имеющие FG-повторы, которые непосредственно участвуют в транспорте, и не имеющие FG-повторы, представляющие собой структурные компаненты ЯПК.
Помимо транспортной функции нуклеопорины имеют также дополнительные функциии:

Ядрышки

Микрофотография ядрышка

Ядрышко- хромосомные участки, определяющие синтез рРНК и образование клеточных рибосом. В растущих ооцитах неск сот ядрышек - амплификация ядрышек. Ядрышки отсутствуют в клетках дробящихся яиц и в дифф. кл - клетки крови
Число ядрышек зависит от числа ядрышковых организаторов - участки, на кот в телофазе происх образование ядрышек интерфазного ядра - образуют вторичные перетяжки х-м. У человека яо расп в коротких плечах 13, 14, 15, 21 и 22 хромосом (10 на диплоидный набор). 82). У кошки - 2; у свиньи - 2; у мыши - 4; у коровы - 8. У хладнокр. позвоночных и птиц обычно 1пара яо х-м
Локализация яо определяется на митотических х-мах окраской солями серебра, связ с яо белками, более точно определение яо методом FISH. Ядрышки могут сливаться др с другом.
Множественность рибосомных генов
при разрыве х-мы на месте вторичной перетяжки ядрышки могут
возникать на каждом из фрагментов х-м – множество копий рибосомных генов - полицистроны - умеренные повторы. У E. coli 6-7 рассеянных по геному идентичных оперонов рРНК- ~1% всей ДНК. Число генов рРНК постоянно в клетке

Амплифицированные ядрышки - гены рРНК мб избыточно реплицированы. При этом дополнительная репликация генов рРНК происходит в целях обеспечения продукции большого количества рибосом. В результате такого сверхсинтеза генов рРНК их копии могут становиться свободными, экстрахромосомными. Эти внехромосомные копии генов рРНК могут функционировать независимо, в результате чего возникает масса свободных дополнительных ядрышек, но уже не связанных структурно с ядрышкообразующими хромосомами. Это явление получило название амплификации генов рРНК. подробно изучено на растущих ооцитах амфибий.
У X. laevis амплификация рДНК, происходит в профазеI. В этом случае количество амплифицированной рДНК (или генов рРНК) становится в 3000 раз больше того, что приходится
на гаплоидное количество рДНК, и соответствует 1,5х106 генов рРНК. Эти сверхчисленные внехромосомные копии и образуют сотни дополнительных ядрышек в растущих ооцитах. В среднем же на одно дополнительное ядрышко приходится несколько сот или тысяч генов рРНК.
Амплифицированные ядрышки встречаются также в ооцитах насекомых. У окаймленного плавунца в ооцитах обнаружено 3х106 экстрахромосомных копий генов рРНК.
После периода созревания ооцита при его двух последовательных делениях дополнит ядрышки в состав митотических хромосом не входят, они отделяются от новых ядер и деградируют.
У Tetrachymena pyriformis в гаплоидном геноме микронуклеуса единственный ген рРНК. В макронуклеусе ~200 копий.
У дрожжей экстрахромосомные копии генов рРНК - циклические ДНК l~3 мкм, сод один ген рРНК.

СТРУКТУРА ЯДРЫШКА
В ядрышке различают гранулярный компанент (гк) и фибриллярный компанент (фк).
Гранулярный компанент представляет собой
гранулы 15-20 нм, обычно расположенные на периферии ядрышка, хотя гк и фк могут быть распределены равномерно.
Фк и гк способны образовывать нитчатые структуры - нуклеолонемы - ядрышковые нити ~100-200 нм, которые могут образовывать отдельные сгущения.
Фибриллярный компанент - представляет собой тонкие (3-5 нм) фибриллы - диффузная часть ядрышек, в центре ядрышка – 1 или 3-5 отдельных зон: фибриллярные центры - частки скопления фибрилл с низкой е лотностью, окруженные зоной фибрилл высокой е плотности - плотный фибриллярный компонент
хроматин – примыкает или окружает ядрышко. 30нм фибриллы хроматина по периферии ядрышка могут заходить в лакуны, м-у нуклеолонемными участками.
белковый сетчатый матрикс –

метод регрессивного окрашивания нк - ионы уранила, связанные с ДНК легко вымываются хелатоном ЭДТА, чем с РНК?окрашенные структуры сод РНК: гранулы (сильно), пфк (слабее), хроматин (не окрашен)

импульсное мечение (3H-уридин), первые следы мечения обнаруживались сначала (через 1-15 мин) в пфк, а затем (до 30 мин) меченым оказывался гк. в фц метка не обнаруживалась?45S пре-рРНК синтезируется в области пфк, а гранулярный компонент ядрышка соответствует прерибосомным частицам (55S-, 40S РНП).
окрашивание осмий-амином, ДНКазы, меченной золотом, связыванием меченого актиномицина, прямой молекулярной гибридизацией с меченой рДНК - что в составе фибриллярных центров находится ДНК, ответственная за синтез рРНК. Зоны фибриллярных центров отличаются от остального хроматина тем, что состоят из тонких хроматиновых фибрилл, значительно обедненных гистоном H1 (что показано с помощью меченных коллоидным золотом антител).

фц: неактивные рибосомные гены, спейсерные участки.
Транскрипция пре-рРНК происходит по периферии фц, где пфк и представляет собой 45S пре-рРНК, располагающиеся в виде “елочек” на деконденсированных участках рДНК После завершения
транскрипции 45S РНК теряет связь с транскрипционной единицей на ДНК в зоне плотного фибриллярного компонента, каким-то еще непонятным образом переходит в гранулярную зону, где и происходит процессинг рРНК, образование и созревание рибосомных субъединиц.

Фибриллярный центр и ядрышковый организатор
Строение и химические характеристики ФЦ оказались практически одинаковыми с таковыми ядрышковых организаторов митотических хромосом. И те и другие построены из тесно ассоциированных фибрилл, толщиной 6-10 нм; и те и другие обладают характерной особенностью - окрашиваться солями серебра, что зависит от наличия особых ядрышковых белков, содержат РНК-полимеразу I.
число ФЦ в интерфазных ядрышках, не соответствует числу ядрышковых организаторов в митозе. Так в клетках культуры СПЭВ число ФЦ может быть в 2-4 раза выше, чем число ядрышковых организаторов .
Более того, количество ФЦ возрастает по мере увеличения плоидности клетки (G2, 4n) и транскрипционной ее активности.
При этом уменьшается величина каждого отдельного фибриллярного центра. Однако суммарные объемы ФЦ при пересчете на гаплоидный хромосомный набор остаются постоянными в интерфазе, но превышают это число вдвое по сравнению метафазой. Другими словами при активации синтеза рРНК наблюдается такое изменение числа ФЦ и их размеров, которое может говорить о какой-то фрагментации исходных ФЦ в относительно мало активных ядрышках.
Противоположная картина наблюдается при затухании синтетических процессов в дифференцирующихся клетках эритроидного ряда мышей (табл. 12). При этом видно, что в размножающихся и активно синтезирующих гемоглобин проэритробластах количество фибриллярных центров зависит от плоидности клетки (88 в G1-фазе, 118 в G2-фазе клеточного цикла), размер индивидуальных ФЦ изменяется мало. После прекращения размножения этих клеток и падении их синтетической активности резко меняются параметры ядрышка. Их объем, уже начиная со стадии базофильного эритробласта
уменьшается в 4-5 раз, а на конечной стадии дифференцировки (нормобласт) - в сотню раз. При этом резко падает число ФЦ (10-40 раз) и возрастает объем почти в 10 раз величины отдельного фибриллярного центра.
Исходя из этих наблюдений можно так представить общую схему активации и инактивации ядрышка (рис. 90) на примере одного ядрышкового организатора.
В неактивной форме ядрышковый организатор представлен в виде одного крупного фибриллярного центра, включающего в себя компактно уложенную часть цепи хромосомной ДНК, несущей тандемно расположенные рибосомные гены (транскрипционные единицы). В начале активации ядрышка происходит деконденсация р-генов на периферии такого фибриллярного центра, эти р-гены начинают транскрибироваться, на них образуются РНП-транскрипты, которые при созревании дают начало появлению гранул - предшественников рибосом по периферии активированного ядрышка. По мере усиления транскрипции единый фибриллярный центр как бы распадается
на ряд более мелких фибриллярных центров, связанных друг с другом полностью декомпактизованными участками рДНК. Чем выше транскрипционная активность ядрышка, тем больше число мелких, связанных друг с другом фибриллярных центров, окруженных плотным фибриллярным компонентом (ПФК), содержащим 45S рРНК. При полной активации ядрышка все мелкие фибриллярные центры деконденсируются; в этом случае зоны плотного фибриллярного компонента содержат всю рДНК, находящуюся в активном состоянии. Такая структура наблюдается у амплифицированных ядрышек растущих ооцитов. В случае инактивации ядрышка происходит постепенная конденсация рДНК, снова образуются фибриллярные центры, они объединяются друг с другом, величина их растет параллельно уменьшению доли ПФК. При полной инактивации, как в случае нормобластов, ядрышко представлено одним крупным (4-5 мкм) сферическим ФЦ, без сопутствующего транскрипции ПФК: оно окружено зоной конденсированного хроматина. Такое инактивированное ядрышко сходно по своим структурным особенностям
с ядрышковым организатором в составе митотических хромосом.
Структурные типы ядрышек
Приведенные выше описания дают основу для понимания разнообразия строения ядрышек в клетках с соответствующим уровнем синтеза рРНК. Однако кроме различной степени выраженности гранулярного и фибриллярных компонентов существуют и иные варианты структурной организации ядрышек. Обычно различают несколько структурных типов ядрышек: ретикулярный или нуклеолонемный, компактный, кольцевидный, остаточный (покоящийся), сегрегированный (рис. 91).
Ретикулярный тип ядрышка наиболее характерен для большинства клеток, для него свойственно нуклеолонемное строение, обилие гранул и фибриллярного плотного материала. Во многих случаях фибриллярные центры выявляются плохо, вероятно из-за высокого уровня транскрипции. Этот тип ядрышек встречается в клетках животных и растений. Так, например, ретикулярный тип ядрышка, свойственный гигантским политенным хромосомам двукрылых насекомых, очень сходен с таковым на гигантских хромосомах
антиподиальных клеток ячменя.
Компактный тип ядрышка отличается от предыдущего меньшей выраженностью нуклеолонемы, большей частотой встречаемости фибриллярных центров. Такие ядрышки характерны для активно размножающихся клеток (клетки растительных меристем, клетки культуры ткани и др.). Вероятно, что оба эти типа могут переходить друг в друга, во всяком случае, они чаще всего встречаются в клетках с высоким уровнем синтеза РНК и белка.
Кольцевидные ядрышки встречаются в клетках животных. В световом микроскопе они имеют форму кольца с оптически светлой центральной зоной - это фибриллярный центр, окруженный РНП-фибриллами и гранулами. Размер этих ядрышек составляет около 1 мкм. Типичные кольцевидные ядрышки характерны для лимфоцитов, эндотелиоцитов,т.е. для клеток с относительно низким уровнем транскрипции.
Остаточные ядрышки характерны для клеток полностью потерявших способность к синтезу рРНК (нормобласты, дифференцированные энтероциты, клетки шиповатого слоя кожного эпителия и др.).
Часто они настолько малы и так окружены конденсированным хроматином, что с трудом обнаруживаются в световом микроскопе. В ряде случаев они могут снова активироваться и переходить в компактную или ретикулярную форму.
Сегрегированные ядрышки характерны для клеток, обработанных различными антибиотиками или химическими веществами, вызывающими прекращение синтеза рРНК (актиномицин Д, амфотерицин и др.), а также антибиотиками, влияющими на синтез ДНК и белков (митомицин, пуромицин, многие канцерогены и т.д.). Термин “сегрегация” используется в данном случае в связи с тем, что происходит как бы разделение, обособление разных компонентов ядрышек, сопровождающиеся прогрессивным уменьшением его объема. При этом обособляются друг от друга крупные фибриллярные центры и гранулярно-фибриллярный компонент.
Белки ядрышек
До 60% сухого веса выделенных ядрышек приходится на белки, число которых может составлять несколько сот разных видов. Помимо белков ассоциированного с ядрышками хроматина в состав
ядрышек входят белки рибосом и специфические ядрышковые белки, связанные с транскрипцией рибосомных генов, с процессингом 45S рРНК, такие как РНК-полимераза I, факторы транскрипции, топоизомеразы, метилазы, нуклеазы, протеинкиназы, фосфатазы. Часть ядрышковых белков имеет сродство к серебру, - аргентофильные белки: РНК-полимераза I, фактор транскрипциии UBF, нуклеолин (С-23), нуклеофозмин (ньюматрин или В-23).
Аргентофилия характерна для белков, обогащенных сульфгидрильными, дисульфидными связями. Как уже указывалось, четкой аргентофилией обладают интерфазные ядрышки и зоны ядрышковых организаторов на митотических хромосомах.
Собственно ядрышковые белки расположены в специфических местах их активности. Так РНК-полимераза I и фактор транскрипции рРНК UBF располагаются в фибриллярных центрах (ФЦ) и/или в плотном фибриллярном компоненте (ПФК).
Ag-фильным является также белок с мол. весом 195 кДа, представляющий собой большую субъединицу РНК-полимеразы I, участвующую
в синтезе рРНК. Этот белок локализуется в зоне фибриллярных центров, по их периферии. На плоскостных препаратах ядрышек аргентофилией обладают участки над осевой частью «елочек», непосредственно над расположением гранул РНК-полимеразы I. Кроме того, с помощью иммуноморфологических методов РНК-полимераза I обнаруживается в зоне ядрышковых организаторов митотических хромосом. Это обстоятельство не противоречит данным о том, что во время митоза транскрипция полностью прекращается. Вероятно, что во время митоза гены, нагруженные неактивной РНК-полимеразой I, переносятся весте с нею в области ядрышковых организаторов из одной клеточной генерации в другую.
Специфический для ядрышек белок фибрилларин (В-36, м.в. 34 кДа) располагается в ПФК, где он осуществляет процессинг пре-рРНК в комплексе другими РНП, в состав которых входит U3 мяРНК, необходимая для начального этапа процессинга 45S рРНК. Фибрилларин обнаруживается также в остаточных ядрышках – в «ядрышковом матриксе».

Белок С23 (110 кДа) или «нуклеолин» локализуется в зоне плотного фибриллярного компонента и в фибриллярных центрах ядрышек, но также и в зонах ядрышковых организаторов митотических хромосом. Следовательно он обнаруживается как на транскрибируемых, так и на неактивных участках рибосомных генов. В препаратах распластанных ядрышек он обнаруживается над транскрипционными единицами («елочками»), он обнаружен во фракциях, содержащих предшественники рибосом. Функции его до конца не ясны, хотя стало известно, что белок С23 может играть важную структурную роль в процессе транскрипции: он своим N-концом, на котором находятся лизиновые группы, связывается с ядрышковым хроматином, а C-концом с транскрибируемым спейсером (tsi) на 45S рРНК.
Обнаружено, что этот белок связывается не с ДНК транскрипционной единицы, а с ДНК, имеющей нуклеосомное строение (вероятно со спейсерными участками).
Белок В-23 (нуклеофозин, м.в. 37 кДа) с помощью иммуноцитохимических методов локализован в области ПФК и, главным образом, в
зоне гранулярного компонента. Считается, что В-23 участвует в промежуточных и терминальных стадиях биогенеза рибосом, и в транспорте пре-рибосом.
Общая схема работы ядрышка как специального локуса синтеза рибосом
При становлении синтеза рРНК в ядрышках на поверхности ФЦ происходит активация транскрипционных единиц, - связывание с факторами транскрипции и РНК_полимеразой I, которая начинает считывать первичный транскрипт рРНК. По мере прохождения первой РНК-полимеразы I, на освобождающемся участке транскрипционной единицы садится следующая РНК-полимераза и начинается синтез новой рРНК. Одновременно и последовательно на одном р-гене могут находиться до сотни РНК-полимераз I, от которых отходят транскрипты разной степени завершенности. Конечным продуктом является пре-рРНК или 45S рРНК. По мере синтеза растущие цепи рРНК одеваются рибосомными белками, поступающими в ядро из цитоплазмы, так что сразу образуются цепи РНП-предшественников. Совокупность продуктов транскрипции нескольких транскрипционных
единиц образует вокруг ФЦ зону ПФК. Конечным продуктом такого синтеза является рибонуклеопротеидный тяж, или глобула, имеющая константу седиментации около 80S, содержащая одну молекулу 45S рРНК. После отделения 45S рРНК в терминальной точке транскрипционной единицы происходит расщепление – процессинг 45S рРНК, в конце которого образуются 40S и 60S рибосомные субъединицы. Синтез малых субъединиц в ядрышке занимает примерно 30 мин, а больших – около 1 ч. В ядрышке незрелая 60S рибосомная субъединица, коме двух фрагментов рРНК (28S и 5,8S) связывается с третьим (5S), который синтезировался независимо от хромосом с ядрышковыми организаторами на других хромосомах. Такие новообразованные рибосомные субъединицы особым образом выходят из ядра в цитоплазму через ядерные поры. В цитоплазме такие незрелые рибосомы могут связаться с дополнительными белками. 40S субъединица сначала связывается с иРНК, и только затем с большой 60S субъединицей, образуя полную 80S функционирующую рибосому (рис. 92).

Новые, неканонические функции ядрышек
Последние данные показывают, что кроме синтеза рРНК, ядрышко участвует во многих других аспектах экспрессии генов.
Первые намеки (1965) на признаки полифункциональности ядрышек были получены при изучении гетерокарионов. Так при слиянии человеческих клеток HeLa с эритроцитами кур были получены гетерокарионы с первоначально совершенно разными ядрами. Ядра клеток HeLa были функционально активны, в них шел синтез разнообразных РНК. Исходные ядра эритроцитов кур содержали сверхконденсированный хроматин, не содержали ядрышек и не транскрибировались. В гетерокарионе после слияния с HeLa клетками в ядрах эритроцитов кур хроматин начинал деконденсироваться, активировалась транскрипция, появлялись ядрышки. Иммуноцитохимическими методами изучалось появление в гетерокарионах белков, характерных для куриных клеток. Несмотря на то, что в клетках HeLa была готовая система функционирования рибосом и были сформированы ядрышки, появление куриных белков было отложено до тех пор
пока не возникнут ядрышки в ядрах эритроцитов. Это означало, что ядрышко куриного эритроцита как-то должно вовлекаться в образование куриных иРНК, т.е. ядрышко должно играть какую-то роль в продукции куриных иРНК.
Позднее были накоплены данные в поддержку этой возможности. Было обнаружено, что созревание (сплайсирование, см. ниже) c-myc иРНК в клетках млекопитающих происходит в ядрышках. В ядрышках обнаружены сплайсосомные малые РНК (sn РНК), факторы сплайсинга пре-иРНК.
Далее в ядрышках обнаруживаются РНК, входящие в SRP-частицы, участвующие в синтезе белков в эндоплазматическом ретикулуме. С ядрышком оказалась ассоциирована РНК теломеразы – рибонуклеопротеида (обратная транскриптаза). Много есть данных о локализации в ядрышках прцессинга малых ядерных РНК, входящих в состав сплайсосом, и даже о процессинге тРНК.
Ядрышко во время митоза: периферический хромосомный материал
В световом микроскопе ядрышко выявляется во время интерфазы,
в митотических клетках оно исчезает. При использовании цейтраферной микрокиносъемки можно наблюдать в живых клетках как по мере конденсации хромосом в интерфазе происходит исчезновение ядрышка. Сначала оно слегка уплотняется, но затем ко времени разрыва ядерной оболочки начинает быстро терять плотность, становится рыхлым и на глазах быстро исчезает, как бы тает. При этом видно, что часть ядрышкового материала растекается между хромосомами. В метафазе и анафазе ядрышки как таковые отсутствуют. Первые признаки новых ядрышек появляются после средней телофазы, когда уже достаточно разрыхлились хромосомы дочерних ядер, имеющие новую ядерную оболочку. В это время вблизи деконденсирующихся хромосом появляются плотные тельца – предъядрышки. Обычно их число выше, чем число ядрышка в интерфазе. Позднее уже в G1-периоде клеточного цикла предъядрышки растут, начинают объединяться друг с другом, их общее число падает, но суммарный объем возрастает. Общий объем ядрышка удваивается в S-G2-фазах. В некоторых случаях в профазе
(культуры клеток человека) при конденсации хромосом крупные ядрышки распадаются на более мелкие, которые в митозе исчезают.
На самом деле никакого полного исчезновения, или «растворения» ядрышка нет: происходит изменение его структуры, редукция одной части его компонентов при сохранении другой. Так было показано, что аргентофильные гранулы в интерфазных ядрышках, обнаруживаемые в световом микроскопе начинают в профазе сливаться друг с другом, одновременно уменьшаясь в объеме, минимальный размер они занимают в метафазе, локализуясь в зонах ядрышковых организаторов хромосом. В таком виде они существуют до средней телофазы, когда выявляются в виде отдельных множественных «предъядрышек», разбросанных среди деконденсированных хромосом. Уже в конце телофазы такие аргентофильные предъядрышки начинают расти. Таким образом можно видеть, что во время митоза исчезновению подвергается только часть ядрышкового компонента, в то время как аргентофильный компонент сохраняется, постоянно существует во время митоза
и переносится на хромосомах в дочерние ядра.
Радиоавтографическими исследованиями было показано, что исчезновение ядрышек совпадает с прекращением синтеза клеточной (в основном рибосомной) РНК, который возобновляется в поздней телофазе, совпадая по времени с появлением новых ядрышек.
Кроме того было обнаружено, что активность РНК-полимеразы I также исчезает на средних стадиях митоза. Это давало основание считать, что новообразование ядрышек связано с восстановление синтеза рРНК в дочерних клетках.
Но с другой стороны существуют факты, указывающие на перманентное, постоянное присутствие ядрышковых компонентов течение всего клеточного цикла. Это относится к Ag-фильному материалу ядрышек в первую очередь.

Во время митоза у животных и растений хромосомы окружены матриксом, представляющем собой скопление рыхло расположенных фибрилл и гранул рибонуклеопротеидов, сходных по составу с компонентами, входящими в состав интерфазных ядрышек.
При конденсации хромосом часть ядрышек диссоциирует и уходит в цитоплазму (большая часть РНП-частиц), в то время как другие тесно связываются с поверхностью хромосом, образуя основу «матрикса», или периферического хромосомного материала (ПХМ).
Этот фибриллярно-гранулярный материал, синтезированный до митоза, переносится хромосомами в дочерние клетки. В ранней телофазе еще в отсутствие синтеза РНК по мере деконденсации хромосом происходит структурное перераспределение компонентов ПХМ. Его фибриллярные компоненты начинают собираться в мелкие ассоциаты – предъядрышки, которые могут сливаться друг с другом, собираться в зоне ядрышкового организатора хромосом в поздней телофазе, где возобновляется транскрипция рРНК.
Ядрышковые белки, участвующие в транскрипции рРНК (РНК-полимераза I, топоизомераза I, фактор инициации транскрипции UBFи др.), аккумулируются в зоне ядрышкового организатора, в то время как белки, связанные с процессингом пре-рРНК (фибрилларин,
нуклеолин, В-23), а также некоторая часть пре-рРНК и малые ядрышковые РНП переносятся поверхностью хромосом в составе периферического хромосомного материала.
Кроме того в состав ПХМ могут входить некоторые негистоновые белки из состава ядерного интерфазного остова.